使用微叉指陣列電極(IDA)的高靈敏度電化學檢測 （介紹連載）
- 第一篇：簡介
- 第二篇：微叉指陣列電極的制作
- 第三篇：微叉指陣列電極的特點
- 第四篇：使用IDA電極的高靈敏度伏安法
- 第五篇：自誘導氧化還原循環
- 第六篇：轉換溶出法
- 第七篇：應用例1. 氧化態標準樣品的測量
- 第八篇：應用例2. 還原態標準樣品的測量
- 第九篇：應用例3. 微量樣品分析
- 第十篇：應用例4. 多巴胺的高靈敏選擇性檢測
- 第十一篇：應用例5. 高效液相色譜的檢測器
簡介
電化學測量常被用來檢測微量物質或觀察物質的反應行為。
在電化學測量中，當電極面積減少到微米量級時，物質向電極的擴散從線性變為球形，從而使單位時間和單位面積到達電極表面的物質的量增加。 因此，觀察到的電流密度增加，并超過了常規測量的極限，這就是為什么微電極會引起人們的關注[1-4]。
因此，利用這些特征可以進行生物傳感器[5]、反應中間體的檢測和反應過程的分析[6]、高電阻溶液和固體中的電化學反應[7]，以及有機電子器件[8-10]等的研究。
使用這些微電極的電化學測量具有以下特點
1)由于電極的尺寸較小，電流值較小，可使iR降減少。這使得測量高電阻的樣品成為可能。
2）雙電層的充電電流減少，可以進行高信噪S/N比的快速測量。由
3）由于擴散是各向同性的，電流密度高，可在短時間內達到穩態。
近年來，LSI制造技術的應用不僅可以可靠且高效地制造盤狀和線狀電極，還可以制造形狀復雜的微電極。
因此，人們發現，通過設計電極形狀和排列方式，可以獲得諸如電流放大和提升選擇性等功能。
在這里，我們以一個微小IDA電極為例，剝離金屬（lift up），得到一個梳狀電極圖案（C）。 圖案的整個表面被絕緣膜覆蓋，在需要被絕緣膜覆蓋的區域再次形成光刻膠圖案，如引線區（D），對未被抗蝕劑覆蓋的絕緣膜進行干蝕，直到電極區暴露出來，得到一個梳狀電極（E）。
另一方面，如果整個基底表面首先覆蓋一層電極材料的薄膜，然后用蝕刻方法進行加工，即使是在低溫下難以制造的材料，如在還原側具有寬電位窗口的碳薄膜和ITO（透明電極），也可以很容易地加工成微電極[11]。
參考文獻
[1] M.Fleischmann, S.Ponds, D.Roison and P.P.Schmidt "Ultramicroelectrodes", Morganton, N.C., 1987.
[2] S.Ponds and M.Flieschmann, Anal. Chem., 59, 1391A (1987).
[3] D.C.Johnson, M.D.Ryan and G.S.Wilson, Anal. Chem., 60, 147R (1988).
[4] 青木幸一、電気化學、56, 608 (1988).
[5] J.Janata and A.Bezegh, Anal. Chem., 60, 62R (1988).
[6] J.O.Howell and R.M.Wightman, J. Phys. Chem., 88, 3915 (1984).
[7] L.Geng, A.G.Ewing, J.C.Jernigan and R.W.Murray,Anal.Chem., 54, 852 (1986).
[8] H.S.White, G.P.Kittlesen and M.S.Wrighton, J. Am. Chem. Soc., 106, 5375 (1984).
[9] G.P.Kittlesen, H.S.White and M.S.Wrighton, J. Am. Chem. Soc., 106, 7389 (1984).
[10] E.T.T.Jones, O.M.Chyan and M.S.Wrighton, J. Am. Chem. Soc., 109, 5526 (1987).
[11] H. Tabei, M. Morita, O. Niwa and T. Horiuchi, J. Electroanal. Chem., 334, 25 (1992).
微叉指陣列電極的制作
微叉指陣列電極的制作工序(概要)在圖1中表示。
使用帶氧化膜的3英寸硅基板。首先在基板表面上涂上光刻膠層，再覆蓋上帶圖案的遮光膜，然后進行紫外線曝光，再用堿性溶液進行顯影后，形成了叉指陣列電極圖案（A ）。接著，將該基板放入濺射裝置中，依次沉積上金屬鉻涂層和金屬金的薄層(B)。
此外，在有機溶劑中將光刻膠層溶解，將光刻膠上覆蓋的不需要的金屬剝離，得到叉指陣列電極圖案(C)。在該圖案的整個表面用絕緣膜覆蓋，在需要被絕緣膜覆蓋的部分如引線部分(D)上再次形成光刻膠圖案，沒有被遮光覆蓋的絕緣膜用干法刻蝕至電極部分露出，得到叉指陣列電極(E)。
另一方面，如果先在基板的整個表面上覆蓋一層電極材料薄膜，然后通過蝕刻方法進行加工，對于那些在低溫下很難制膜的具有寬還原電位窗的碳薄膜或ITO（透明電極）膜材料也可以很容易地加工成微電極。
圖 1 微叉指陣列電極的制造工藝（概要）
（*出售的叉指陣列電極可能會因改良等而略有不同。）
微叉指陣列電極的特點
叉指陣列電極除了作為帶狀電極的集合體之外，通過將兩個叉指狀電極彼此的交叉排列（圖3-1），其表現出在其他電極中看不到的有趣行為。即，在一個電極（G極：generator electrode ）上被氧化的氧化態物質可以在另一電極（C級：collector electrode）上被還原。
圖3-1 叉指陣列電極的示意圖）
圖 3-2. 氧化還原循環的概念圖）
叉指陣列電極的臨界穩態電流可以通過求解二維擴散方程解析得到，并由下式表示:
p = 4S / (1 + S)2? （2）
S = sin (πg / 2w) / cos (π (w?a?--w?c?/ 4w)) (3）
w = (w?a?+ w?c?? ) / 2 + g （4）
其中 K () 為第一類全橢圓積分，m, b, n, F, C*, D, w?a?, w?c?, g 分別為叉指的數量、長度、反應電子數、法拉第常數、本體溶液濃度、擴散系數、陽極，陰極的電極寬度和電極間距。當陽極和陰極的電極寬度相同且g <0.85w時，可以近似成下式[3-1] 。
參考文獻
[3-1] K.Aoki, M.Morita, O.Niwa and H.Tabei, J. Electroanal. Chem., 256(2), 269 (1988).
使用IDA電極的高靈敏度伏安法
圖4-1是使用叉指陣列電極測量二茂鐵的循環伏安圖。
圖4-1 叉指陣列電極的循環伏安法測量圖
在(A)中，G電極上的氧化電流從0.4V左右開始增加，C電極上的還原電流也相應增加，在0.6V左右，兩者都變為絕對值大致相同的定值。
還原電流(Ic)與氧化電流(Ia)之比稱為捕獲率(Capture Efficiency, C. E.) ，表示在 G電極上產生的氧化態物質到達 C電極的程度。
使用微叉指陣列電極進行伏安測量，可獲得90%以上的高捕獲率。 另一方面，如果沒有對C電極施加電位，就不會發生氧化還原循環，反應是基于正常的擴散速率，導致G電極的電流Io較小。
因此，將C電極上施加電位狀態下的G電極上的氧化電流值I?a的與Io的比（Ia/Io）定義為氧化還原循環數，并用作比較電流增加率的表觀指標。
圖 3-2. 氧化還原循環的概念圖
此外，當檢查具有不同擴散系數的氧化還原物質的捕獲率和氧化還原循環次數時，發現兩者僅由電極形狀決定，而與氧化還原物質無關。
圖5顯示了四種可逆活性物質的氧化還原循環次數的形狀依賴性。特別是當電極小型化時，氧化還原循環次數急劇增加，臨界電流隨著循環次數的增加而增加。這表明通過小型化提高靈敏度是有效的。
自誘導氧化還原循環
氧化還原循環是在相鄰的兩個電極上設置不同電位時發生的現象（一個電極是氧化電位，另一個是還原電位），通過采用特殊的電極配置，只需控制一個電極上的電位即可開始氧化還原循環。
特殊電極結構是指將大面積的導體(大電極)配置在用于控制電位的微電極附近的情況。
當微電極外圍為絕緣體時，微電極產生的還原態物質僅靠濃度梯度自發擴散，以消除濃度差（圖3-2）。然而，當大電極設置在微電極附近設置了大電極時，生成的還原態物質擴散到大電極，然后在大電極面向微電極的點上被氧化，同時大電極上遠離微電極的點上誘發還原反應。此時，由于氧化反應產生的電子在還原反應中被消耗，所以電子在大電極內部移動，即有電流流動。
大電極兩端發生逆向反應的原因是為了消除微電極產生的還原態物質的濃度梯度，但由于，大電極中的電子運動的過程遠大于還原態物質的自然擴散過程，成為主導。此外，在大電極處產生的氧化態物質擴散到微電極，再次還原從而并引發氧化還原循環。
由于這種自然誘導的氧化還原循環（自誘導氧化還原循環），通過僅控制微電極的電位來放大臨界電流（圖 3-2）。這種自生氧化還原循環現象是通過在絕緣體中設置微圓電極的電極和薄膜分離的宏觀電極中設置微圓電極的電極中獲得的臨界電流值進行比較來確認。
僅控制后一個微電極的電位得到的極限電流值比控制前一個電極的電位得到的極限電流值大幾倍，當通過控制電位人為地誘導氧化還原循環時，后者的大電極也等于極限電流值。
更直接的確認是測量流過大電極的電流，這可以通過電流表將 IDA 的一個叉指電極連接到另一個大電極來實現。..?表現出自誘導氧化還原循環時的電流值等于在雙模式下測量 IDA 時的法拉第電流值。
此外，自誘導氧化還原循環效應可以在雙電池中得到證實，其中 IDA 電極和大電極位于單獨的電池中，電池通過鹽橋連接（圖 4-1）。
圖5-1 雙池體系自誘導氧化還原循環
轉換溶出法
如果在容納大電極的電化學池中的氧化還原物質被可沉淀的物質代替，也會能發生自誘導氧化還原循環。特別是，通過使用重金屬離子和鹵素離子，其沉淀和溶解可以通過電極的電位來控制，如下所示可以對檢測電流進行轉換和積分[6-1][6-2]。
在IDA電極一側的電解池中容納了樣品溶液，而在大電極一側的電解池中則容納了可沉淀物質，然后控制IDA的一組梳狀電極的電位對樣品進行前電解（預電解）處理（圖6b），由于自我誘導的氧化還原循環，在大電極上誘導了沉淀反應。 根據電荷守恒定律，該沉淀析出的量等于樣品在梳狀電極上發生電解的量。
換句話說，可以將樣品的檢測電流轉化為另一種物質的沉淀電流。此外，樣品的長期電解會導致大量沉淀，因為只要樣品繼續電解，沉淀反應就會在大電極處繼續進行。換言之，檢測到的電流可以隨時間積分。沉積在大電極上的物質的量可以通過的溶出方法進行定量（圖 6c）。
這是通過測量大電極電位掃描時獲得的電流峰值來實現的。 沉淀的總量以及因此而產生的樣品的總電解量可以通過峰面積進行定量。 假設在樣品預電解期間有穩定的電流流動，可以從由總電解量、預電解時間和IDA幾何形狀確定的極限電流值來確定樣品的濃度。
這種分析方法被命名為轉換溶出法，因為它是將樣品的檢測電流轉換成另一種物質的沉淀電流，沉淀物是通過普通溶出分析進行的。這種分析方法是兩步電流放大法。因此，它可以對極低濃度的可逆氧化還原物質進行量化。 換句話說，它是氧化還原循環的第一次電流放大和沉積材料的時間積分的第二次放大效應。
圖 6-1. 轉換溶出法原理圖）
(a) 自誘導氧化還原循環也能發生在雙池體系中，可以觀察到梳狀電極和大電極之間流動的電流。
(b) 如果將右池中的氧化還原物質轉換成在電極上沉淀的物質，如重金屬離子，自誘導氧化還原循環仍會發展，左側池中的反應量與右側池中的沉淀量相等。
(c）通過控制大電極的電位，可以溶解（b）中沉積的重金屬離子。 溶解量等于在左側池中進行的反應量。
參考文獻：
[6-1] T. Horiuchi, O. Niwa, M. Morita and H. Tabei , Anal. Chem.,64 (1992) 3206.
[6-2] T. Horiuchi, O. Niwa, M. Morita and H. Tabei, Denki Kagaku.,60 (1992)1130.
應用例(1)氧化態標準樣品的測量
作為轉換溶出法的測定例，對六胺釕的檢測結果進行說明。六胺釕是以氧化態溶解的可逆氧化還原物質，適合作為轉換溶出法的標準物質。
圖7為測量體系的構成示意圖。
對于測量池，將特氟隆燒杯與鹽橋連接，鹽橋使用裝有飽和硝酸鉀溶液且管的兩端封入多孔玻璃。IDA、Ag / AgCl 參比電極和 Pt 對電極放置在左側池中用于測量樣品，玻璃碳 (GC) 電極作為大電極放置在右側池中用于沉淀物。參比電極和對電極與恒電位儀的對應端子相連，IDA電極的兩個電極端子和GC電極端子通過開關盒與恒電位儀的工作電極端子相連。
該開關盒用于預電解階段和溶解剝離階段之間的切換，在預電解階段，IDA的一個工作電極（生成電極,G電極）連接到恒電位儀，另一個工作電極（收集電極, C電極）連接到大電極。在溶出剝離階段，構成了一個電路來將大電極連接到恒電位儀。
通過將六胺釕溶解在 pH 4 的標準緩沖溶液中制備樣品。用于沉淀的溶液是硝酸銀溶解在硝酸鉀水溶液(0.1mol/dm 3 )中。用轉換溶出法檢測六胺釕分以下兩個步驟進行。
圖7-1 轉換溶出法的測量池配置
圖7-2 轉換溶出法的電位印加示意圖
六胺釕的濃度為1µmol/dm 3。(A)是在-0.4V預電解六胺釕10分鐘后獲得的銀離子的溶出伏安圖。另一方面，(b)是在0V下進行10分鐘的預電解后得到的。(C) 在無釕六胺溶液中在 -0.4 V 下預電解 10 分鐘后得到的。
僅當六胺釕存在下進行電解時，才能觀察到大的金屬銀的溶解剝離峰。在收集電極和發生電極之間插入電流表以監測在預電解階段流動的電流，并確認在預電解開始后約30秒達到穩定狀態。
由上可知，在轉換溶解法中，左邊電解槽中的六胺釕在發生電極上被還原，生成的還原產物在收集電極上氧化，氧化反應產生的電子用于右邊銀離子的沉淀池。它變得清晰了。還揭示了在收集器中產生的氧化劑形成了一個自誘導的氧化還原循環，在這個循環中它再次被發生器還原，使得在收集器和GC之間流動的電流達到了一個穩定的狀態。
因此，預電解時間與銀析出量成正比，說明長期預電解對低濃度檢測有效。
圖7-3 1 µ mol/dm3六胺釕轉換溶出伏安圖
(a)，含六胺釕的溶液在 -0.4 V 下預電解 10 分鐘。
(b)、將含有六胺釕的溶液在 0 V 下預電解 10 分鐘。
(c)不含六胺釕的溶液在-0.4V預電解10分鐘。
所有電位掃描速度均為20mV/s
圖7-4 10 pmol/dm3六胺釕轉換溶出伏安圖
(a)用含有六胺釕的溶液測量,(b)不含六胺釕的溶液測量。每個伏安圖
右側的數字是預電解時間。出現在0.3V位置的峰表示檢測到六胺釕
圖7-5 pmol/dm3濃度范圍的校準曲線，預電解時間為10分鐘。實線是計算值。
參考文獻：
[7-1] J.Janata and A.Bezegh, Anal. Chem., 60, 62R (1988).
[7-2] T. Horiuchi, O. Niwa and H. Tabei, Anal. Chem., 1994, 66, 3500;
[7-3]（14) K. Aoki, M. Morita, O. Niwa and H. Tabei, J. Electroanal. Chem., 256(1988) 269.
應用例(2)還原態標準樣品的測量
到目前為止，我們已經介紹了對溶解在氧化狀態的氧化還原物質應用轉換溶出法的例子，但是轉換溶出法方法也可以應用于溶解在還原狀態的可逆氧化還原物質。下面，將介紹合將水溶性二茂鐵作為溶解在還原狀態的標準試樣，用于轉換溶出法的結果。
水溶性二茂鐵的轉換溶出法的檢測機理和方法與六胺釕相似。不同的是氧化反應和還原反應是相反的，對應的電子傳遞的方向也相反。如圖8-1所示，在預電解階段，在發生電極上發生氧化反應，在收集電極上發生還原反應，因此收集電極上的還原反應所需的電子必須由大電極提供。
圖8-1 溶解的還原態可逆氧化還原物質的預電解機理。每個電極上的氧化和還原反應與溶解的氧化態物質時相反。
IDA電極和大電極之間的電流方向也相反。沉淀的物質是陰離子。
圖8-2顯示了通過轉換溶出法檢測水溶性二茂鐵的例子。將水溶性二茂鐵以1µmol/dm3的濃度溶解在pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中。通過將碘化鉀溶解在0.1mmol/dm3硝酸鉀水溶液中至濃度為1µmol/dm3來制備沉積溶液。取決于預電解時間，觀察到一個大的陰極電流峰，而在無水溶性二茂鐵存在的實驗中沒有觀察到這個峰。由此確認了通過水溶性二茂鐵的電解在大電極上析出碘離子，并確認了析出的碘離子在反萃取工序中溶解的機理。
圖8-2 水溶性二茂鐵的轉換溶出伏安圖
測量值可以被擬合為一個sigmoid函數。 通過非線性最小二乘法可以確定一個有氧化還原電位意義的擬合參數為0.38V，這與水溶性二茂鐵的氧化還原電位值一致。 這種測量相當于用梳狀電極在雙電極模式下的循環伏安法，但檢測電流的極大大的放大表明，對低濃度樣品進行循環伏安法測量是可能的。 然而，這種測量需要很長的測量時間，因為每獲得一個點都要進行預電解。 這可以通過使用由許多對梳狀電極和大電極組成的電極系統進行轉換溶出來解決。
圖8-3 預電解電位和溶出峰之間的關系
1μ mol/dm3的水溶性二茂鐵在不同的預電解電位下被預電解5分鐘。
實線是用sigmoid函數擬合的曲線。
應用例(3)微量樣品分析
圖9-1 預電解電位與溶出峰的關系。
通過改變預電解電位，將 1 µmol/dm3 水溶性二茂鐵預電解 5 分鐘。
實線擬合 sigmoid 函數。
圖9-2 IDA電極上微量樣品的伏安圖。
參考文獻
[9-1] O. Niwa, Y. Xu, H. B. Halsall and W. R. Heineman, Anal. Chem., 65, 1559 (1993).
應用例(4)多巴胺的高靈敏選擇性檢測
與二茂鐵等典型的可逆物質相比，多巴胺的電子傳遞速度慢，而且不穩定（在高pH值下）， 是一種可能由于電化學反應后的化學反應而會隨時間變化的物質。因此，通過使用這種微電極，在G極產生的氧化還原物質可以在很短的時間內被C極捕獲，從而有望能出現捕獲和恢復不穩定中間物的顯著效果。
圖10-1顯示了GC模式和O模式下多巴胺的CV測量值。在通常的測量方法 O 模式下，峰值波形不對稱，但在 GC 模式下，觀察到較大的限制電流，表明可以進行高靈敏度測量。
圖 10-1. IDA電極上的多巴胺 CV測量結果
在10nM，一個數量級的低濃度下，在陽極一側不能獲得可定量化的曲線，但在陰極一側可以進行定量的測量，盡管可以觀察到由于剩余電流導致的基線斜率。 在很寬的濃度范圍內觀察到與氧化還原有關的極限電流，并觀察到濃度和電流之間的良好線性關系（圖18）。 這表明IDA電極對微量成分的定量檢測是有效的。
圖10-2 低濃度多巴胺的伏安圖
圖 10-3 多巴胺極限電流的濃度依賴性圖。
另一方面，較小尺寸的電極（3µm 電極寬度，2µm 間隙），如圖10-4右側所示，即使在混合體系中也能觀察到多巴胺的極限電流，這表明多巴胺的氧化物種在變化之前就在還原電極上被檢測到（d）。 這種選擇性明確地取決于電極的幾何形狀，并有望隨著電極的變小而得到改善。 由于IDA電極本身的選擇性和聚合物膜的改性，可以預期進一步的選擇性檢測。
圖10-4多巴胺和抗壞血酸的伏安圖。
測量是通過在梳狀電極的C電極上施加多巴胺的還原電位和在G電極上從0V到多巴胺的氧化電位進行的。 在樣品中沒有抗壞血酸的情況下，C電極上的電流在電位步驟后立即達到穩定狀態，表明氧化的多巴胺在膜上迅速擴散。 另一方面，當電極被Nafion單層修飾時，由于多巴胺在膜中的低擴散率，快速反應沒有實現，電流的絕對值下降。
其次，在含有過量抗壞血酸的樣品中，C電極上的電流一開始很低，但幾秒鐘后就增加了，并與不含抗壞血酸的樣品中得到的數值幾乎相同。 在施加電位后，由于下層薄膜中存在L-抗壞血酸，大部分在G極氧化的多巴胺在到達C極之前就被還原了，而L-抗壞血酸的選擇性很低。 然而，由于Nafion膜的原因，抗壞血酸每次只能從溶液中提供一點進入膜，所以膜中的濃度迅速下降。
圖 10-5 用親水/聚酯離聚物雙層膜修飾的梳狀電極上的多巴胺選擇性
多巴胺：10 μM，L-抗壞血酸，a：0 μM，b：200 μM，c：600 μM，d：1000 μM
[10-1] O. Niwa, Y. Xu, H. B. Halsall and W. R. Heineman, Anal. Chem., 65, 1559 (1993).
應用于高效液相色譜的檢測器
高效液相色譜的電化學檢測 (HPLC-EC) 與發光和熒光檢測一起被認為是高靈敏的檢測方法。在流動體系中使用叉指陣列IDA電極進行電化學測量的效果不如在靜態體系中的測量，因為流動減少了氧化還原循環的次數。但是，近年來，生物樣品等的測定使用 1 mm 以下的極小色譜柱，在這種情況下，使用叉指陣列IDA電極作為檢測器是有效的，因為與傳統電極相比，它使用了非常小的流速。
圖 11. 標準尺寸微孔柱與IDA電極檢測器組合得到的多巴胺校準曲線 ○：3mm 直徑柱 □：1mm 直徑微孔柱
傳統上，金和鉑等金屬已被用于此類薄膜微電極探測器。 盡管金屬適合于微細加工，但它們有一些問題，如在用于色譜檢測器時，由于其對氫和氧的還原過電壓較低，所以在還原方面的檢測靈敏度較低。
最近，因為建立了有機化合物的熱CVD方法及其微細加工工藝，并能夠制造出微米級圖案的碳梳狀電極。
在色譜檢測器中使用IDA電極可以獲得多巴胺 100 pM（絕對量小于 1 fmol）的低檢測限。